ПЦР на микобактерии туберкулеза: особенности проведения

Полимеразная цепная реакция (далее ПЦР) — это высокоточный метод молекулярно-генетического исследования материла, который позволяет выявить у человека различные инфекционные заболевания и установить генотип возбудителя.

ПЦР для выявления различных заболеваний стала применяться в самом конце прошлого века. Первооткрывателем этого метода исследования является американский биохимик Кэри Муллис. Свое открытие он сделал в 1983 году. Но еще несколько лет понадобилось, чтобы доработать метод.

Суть метода

С помощью ПЦР-диагностики можно обнаружить фрагменты чужеродного ДНК в любой жидкой среде организма. На анализ могут быть взяты такие жидкости:

Кровь.
Слюна.
Мокрота.
Выделения из половых органов.
Смывная жидкость бронхов.
Желудочный сок.

Лечащий врач сам определяет, какую биологическую жидкость лучше взять на анализ при конкретном заболевании.

ПЦР-диагностика позволяет не только обнаружить микрофрагменты чужеродной ДНК, но и определить к какому конкретному виду она относится. То есть с помощью ПЦР можно не только точно установить возбудителя заболевания, но и выяснить к какому виду он принадлежит.

Процесс анализа ПЦР — очень сложный. Он состоит из нескольких этапов:

Сначала нужно обнаружить фрагменты вредоносной ДНК в предоставленном образце.
Копирование фрагмента ДНК. Маленького участка ДНК для анализа недостаточно, поэтому его копируют. Нуклеиновая кислота может копироваться в пробирке с помощью фермента полимеразы (вне живого организма). В пробирке образуется множество клонов, то есть происходит цепная реакция. Весь процесс происходит в три этапа под воздействием различных температур.
Когда генетического материала становится достаточно для исследования, тогда возбудитель определяется обычными методами.

Метод ПЦР очень точен и может выявить наличие любого возбудителя по небольшому фрагменту ДНК или РНК.

ПЦР-исследование туберкулеза

ПЦР-анализ на туберкулез является самым информативным методом диагностирования этого заболевания. Относительно туберкулеза этот метод позволяет не только установить наличие микобактерий в организме, но и определить к какому виду они принадлежат.

Результат ПЦР диагностики может быть простой и расширенный. В простом результате указывается только наличие/отсутствие микобактерии. Расширенный результат дает представление о дополнительных параметрах протекания заболевания. Правильно понять, что написано в результате анализа ПЦР может только фтизиатр.

Показания для проведения ПЦР-исследования туберкулеза

ПЦР-диагностика туберкулеза не проводится всем без исключения. Это объясняется дороговизной реактивов и недоступностью проведения исследования в некоторых отдалённых районах (в таких местах пользуются другими методами диагностики).

Показаниями для проведения ПЦР-исследования являются:

Длительный контакт с больным туберкулезом.
Беременность. ПЦР крови на туберкулез является самым быстрым и безопасным методом для беременной женщины.
Экстренная ситуация. Например, необходимость срочного оперативного вмешательства, при котором нужно точно установить наличие/отсутствие туберкулеза в организме.
Аллергическая реакция на туберкулиновые пробы.
ВИЧ-инфекция.
Невозможность диагностирования заболевания другими способами, при наличии явных признаков туберкулеза.
Неоднозначные симптомы, которые не позволяют создать четкую клиническую картину заболевания (болезни верхних дыхательных путей, сопровождающиеся большим количеством мокроты, кровохарканьем и пр.).

Метод ПЦР, при всей своей сложности и дороговизне, проводится и расшифровывается в течение нескольких часов. Что делает этот метод золотым стандартом при диагностике туберкулезной инфекции.

Забор материала

Забор материала — это первый этап при выполнении ПЦР-исследования. Для того, чтобы выполнить качественный анализ, нужно соблюдать определенные правила по сбору материла:

Для ПЦР мокроты на туберкулез нужно тщательно провести туалет полости рта. Делать это нужно вечером и утром перед анализом. Все это время не есть. Вечером выпить муколитическое средство для лучшего отхождения мокроты.
Перед сдачей крови на ПЦР нужно не употреблять пищу в течение 8 часов. Лучше всего производить забор крови утором натощак. Курить перед забором крови также нельзя. Кровь берется из вены на локтевом сгибе руки в стерильную пробирку. В эту же емкость добавляется антикоагулянт, чтобы кровь оставалась жидкой. Смешивать антикоагулянт с кровью нужно очень аккуратно, не делая резких движений. Если кровь была взята не в лабораторных условиях, то она должна быть предоставлена лаборанту до истечения пятичасового срока. Иначе результат может быть не точным.
Моча собирается в стерильную емкость утром, до приема пищи. Перед сбором мочи необходим тщательный туалет промежности.
Остальные виды жидкостей (смывы с бронхов, спинномозговая жидкость) может собрать только специалист в условиях стационара.
Перед забором жидкостей на ПЦР-исследование запрещено принимать некоторые препараты (например, прием некоторых антибиотиков нужно прекратить за две недели до забора материала).
Требования к лаборатории, в которой проводится забор анализов на ПЦР очень строгие. Лаборатория должна быть стерильна, чтобы не произошло перекрестное загрязнение материала. В этом случае результаты могут быть ложноположительными.

ПЦР-тест на туберкулез — высокоточный информативный анализ. И требования к его проведению крайне строгие. Чтобы анализ получился, нужно соблюдать регламент.

Требования к ПЦР-лаборатории

Для работы в ПЦР-лаборатории приглашаются специально обученные врачи: бактериологи, вирусологи, микробиологи. Все они прошли дополнительное обучение для работы на сложном оборудовании.

Лаборатория должна иметь лицензию на выполнение работ связанных с бактериологически-опасными вирусами и бактериями.

В самой лаборатории должны быть выделены такие рабочие зоны:

Зона приемки и сортировки проб.
Зона подготовки проб. В этом помещении выделяются нуклеиновые кислоты из образцов материала.
Зона проведения реакционных проб.
Зона для учета результатов и расшифровки анализов.

Все помещения располагают последовательно. Допуск в эти зоны разрешен только работающим там сотрудникам, которые при входе соблюдают правила личной защиты от бактерий и вирусов.

Лучше, если есть возможность расположить лабораторию в отдельно стоящем здании с собственной системой вентиляции.

В лаборатории соблюдаются стерильные условия работы, чтобы избежать перекрестного загрязнения проб. Даже если один фрагмент чужеродной ДНК попадет в исследуемый материал, ПЦР его размножит, и анализ получится ложноположительным.

В каждой зоне лаборатории имеется свой набор оборудования и посуды для проведения исследований. Также имеются свои холодильники, которые не могут быть использованы в других целях, кроме хранения материала конкретной зоны исследований.

Использованные расходные материалы и остатки биологического материала уничтожаются специальными способами, в соответствии с инструкциями.

Плюсы ПЦР-диагностики

ПЦР-тест на туберкулез имеет множество плюсов, которые делают этот метод диагностики все более востребованным:

Срок проведения. Несмотря на сложность проведения анализа, он готовится намного быстрее других лабораторных методов диагностики туберкулеза (около пяти часов). Это свойство анализа ПЦР становится особенно важным, когда анализ необходимо провести экстренно.
Анализ ПЦР абсолютно безопасен и может проводиться беременным женщинам и детям.
ПЦР-исследование можно сделать, когда по каким-то причинам нельзя выполнить другие методы диагностики.
С помощью ПЦР-диагностики можно провести исследование любой биологической жидкости на выбор. В некоторых случаях это имеет большое значение.
Позволяет обнаружить возбудителя на любой фазе заболевания. Даже после проведенного лечения, сохранившиеся остатки ДНК мертвых микобактерий будут обнаружены.
Высочайшая чувствительность этого метода позволяет обнаруживать в биологическом материале даже единичные фрагменты ДНК микроорганизмов.
Метод ПЦР позволяет не только обнаружить присутствие заболевания, но и может определить генотип возбудителя, отличив его от похожих микроорганизмов.
ПЦР-исследование очень эффективно при рецидивирующем течении заболевания.
Благодаря высочайшей чувствительности, анализ ПЦР может распознать микобактерии в организме человека, когда он только недавно инфицировался туберкулезом, задолго до появления клинических симптомов.

Казалось бы, метод ПЦР-диагностики содержит в себе только плюсы, но это не так.

Минусы ПЦР-диагностики

Минусы этого метода исследования тоже существенны. При выборе метода исследования туберкулеза это также стоит учитывать:

Это дорогостоящий метод исследования. Для проведения ПЦР-диагностики нужна специально-оборудованная лаборатория. Оборудование для таких исследований стоит очень дорого, и не во всякой лаборатории оно имеется. В крайнем случае, можно обратиться в платную лабораторию.
Сразу же после проведенного лечения метод ПЦР применять не рекомендуется. В крови пациента некоторое время сохраняется небольшое количество живых и мертвых микобактерий. Если провести анализ в этот период, он покажет ложноположительный результат.
При мутациях микобактерий, анализ будет недостоверным, так как нормальная ДНК не сможет синтезироваться.
Для ПЦР-исследования имеет значение правильный выбор биологической жидкости на анализ.
Сверхчувствительность. Это тот случай, когда достоинство метода становится его недостатком. Если при проведении анализа в биологический материал каким-то образом попадет даже единичный фрагмент чужеродного ДНК, то ПЦР его размножит, и будет получен ложный результат.

Где пройти ПЦР-исследование на туберкулез

ПЦР-лаборатория имеется только в крупных противотуберкулезных диспансерах и диагностических центрах.

Объясняется это высокой стоимостью оборудования и высокими требованиями к содержанию лаборатории (реактивы, обработка).
Медицинские чиновники не сильно переживают из-за отсутствия ПЦР-лаборатории в каком-то конкретном населенном пункте, поскольку анализы на туберкулёз можно провести другими методами (культивирование микобактерий, микроскопическое исследование).
Если в населённом пункте нет бесплатной ПЦР-лаборатории, пациент по желанию может обратиться в платное учреждение.
В последнее время ПЦР-диагностика занимает все более прочные позиции в диагностике туберкулеза и других заболеваний, отодвигая на задний план другие методы диагностики.

Пцр на туберкулез: диагностика туберкулеза, анализ крови, тест на микобактерии

Несмотря на колоссальные достижения в области медицины, человечество до сих пор не может полностью взять под контроль такое опасное заболевание, как туберкулез. В борьбе с этой инфекцией усовершенствовались методы диагностики, вакцинация, способы лечения.

Но туберкулез по-прежнему нередко приводит к смертельному исходу. Уберечься от страшной инфекции можно, если вести здоровый образ жизни, проводить плановую вакцинацию и регулярное обследование. Полностью исцелиться в случае заражения поможет только ранняя диагностика.

Анализ крови ПЦР на туберкулез позволяет на самых ранних сроках выявить палочку Коха.

Туберкулез что за инфекция

Туберкулез (устаревшее название чахотка) ― это инфекционная патология, поражающая чаще всего органы дыхания.

Микобактерии туберкулеза распространяются воздушно-капельным путем при чихании и кашле зараженного человека или животного. Опасность для инфицирования также представляет слюнная жидкость больного туберкулезом.

После попадания в организм часто наличие инфекции никак не проявляется, то есть заболевание протекает в скрытой форме.

В зависимости от течения болезни выделяют две формы туберкулезной инфекции:

Закрытую стадию туберкулеза фтизиатры относят к малоопасной либо вообще неопасной, с точки зрения заражения окружающих. Микобактерии при скрытой форме в мокроте не выявляются доступными диагностическими методами, в том числе и посредством анализа ПЦР. Опасно это состояние тем, что в одном из десяти случаев оно может переходить в активную стадию, то есть в открытую форму туберкулеза.
Открытую стадию туберкулезного инфицирования характеризует обнаружение в мокроте и в иных биологических жидкостях организма палочек Коха. При такой форме заболевания пациент крайне опасен для окружающих его людей даже при соблюдении норм гигиены.

К востребованным диагностическим мероприятиям по обнаружению туберкулезных микобактерий относятся флюорография, томография и рентгенография грудной клетки и иных пораженных органов.

С успехом проводятся исследования разного биологического материала, а также кожная туберкулиновая проба она же реакция Манту.

Но наиболее эффективен молекулярно-генетический анализ полимеразной цепной реакции, сокращенно именуемый ПЦР.

Что представляет из себя исследование ПЦР на туберкулезную инфекцию

Полимеразная цепная реакция ― это точнейшая молекулярно-генетическая диагностика. Анализ ПЦР при туберкулезном инфицировании позволяет с большой достоверностью выявить присутствие ДНК или РНК возбудителя в изучаемой пробе крови или иных биологических жидкостях организма.

К многочисленным достоинствам диагностического метода ПЦР относится то обстоятельство, что для проведения исследования при помощи особого фермента полимеразы, может быть достаточно совсем незначительного числа бактерий, хватит и единичной клетки.

Другие преимущества при ПЦР диагностике туберкулеза:

Безупречная точность полимеразной цепной реакции при анализе на туберкулезное заражение достигается за счет особенного фрагмента, относящегося к конкретному возбудителю, в данном случае микобактериям туберкулеза.
Гарантия стопроцентного результата благодаря чувствительности анализа ПЦР, которая составляет от десяти до тысячи клеток в исследуемом образце, в биологическом материале реально выявить даже единственную клетку туберкулезной микобактерии.
Самое срочное получение результатов обследования всего лишь в течение 3,5–5,5 часов с момента сдачи анализа ПЦР на микобактерии туберкулеза.

Анализ ПЦР при туберкулезе несомненный прорыв в области постановки ранних и точных диагнозов.

С момента появления молекулярно-генетического метода диагностики стало возможным обнаружить туберкулез и другие смертельно опасные инфекции на самой ранней стадии, спустя дни или максимум несколько недель после заражения.

Когда возбудители только начинают атаку на организм, их еще можно уничтожить без последствий для органов и систем тела человека.

Микобактерии туберкулеза обладают характерной особенностью, значительно усложняющей излечение этого заболевания, ― способность приспосабливаться к медикаментозному воздействию некоторыми препаратами.

Анализ ПЦР при туберкулезе дает возможность выяснить восприимчивость микобактерий туберкулеза к назначенному препарату и тем самым установить эффективность терапии.

При проведении исследования ПЦР с целью определения устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам используют способность генов возбудителя «запоминать» невосприимчивость к конкретному препарату. Результат исследования генов на устойчивость к лекарствам можно получить уже через два дня после сдачи анализа ПЦР.

Как выполняется метод ПЦР при туберкулезе

Сущность диагностики путем полимеразной цепной реакции состоит в выделении из биологических жидкостей пациента часиц ДНК возбудителя и последующей классификации его по типу микроорганизма.

Для обнаружения возбудителя достаточно даже самого микроскопического его фрагмента цепочки ДНК.

К длинному списку достоинств анализа на туберкулез посредством ПЦР можно добавить и абсолютную простоту данного исследования.

Этапы диагностики туберкулеза при помощи полимеразной цепной реакции:

В качестве исследуемых образцов используют кровь, мокроту, промывные жидкости бронхов.
Далее, биологический материал в течение нескольких минут подвергают воздействию высоких температур, доходящих до 97 градусов по Цельсию. За счет чего происходит разрушение (денатурация) первоначальной структуры ДНК возбудителя, состоящей из пары цепей.
Следующей операцией является отжиг, при котором температура снижается, чтобы дать праймеру соединиться с одной из разъединенных во время предыдущей процедуры цепей ДНК.
Завершающим этапом выступает элонгация, во время которой осуществляется биологический синтез необходимых молекул.

Понадобится около 25–30 циклов, чтобы получить требующееся количество копий ДНК возбудителя, которые уже можно классифицировать в зависимости от принадлежности к определенному штамму. Для выполнения исследования посредством полимеразной цепной реакции требуется специальное дорогостоящее оборудование. Установка подобных приспособлений не везде возможна.

Поэтому анализы ПЦР при подозрении на туберкулез нельзя назвать самыми доступными по финансам.

Но в некоторых обстоятельствах, когда дорога каждая минута, в силу возраста или каких-то особенностей организма противопоказаны иные методы диагностики, ПЦР анализу нет равных, так как он абсолютно безопасен.

Диагностика ПЦР при туберкулезной патологии назначается в случае спорной ситуации, если отсутствует яркая клиническая картина, а другие способы исследования показывают противоречивые результаты.

Эффективно подобное обследование крови или других биологических жидкостей при рецидиве туберкулеза.

Помимо отсутствия или наличия штамма конкретной микобактерии туберкулеза. При помощи полимеразной цепной реакции существует возможность определить на какой стадии находится заболевание.

Но необходимо учитывать, что если анализ ПЦР будет проводиться у лиц, прошедших курс терапии от туберкулезного поражения.

Тогда в крови и иных исследуемых образцах может оставаться незначительное количество погибших или еще на стадии умерщвления микобактерий туберкулеза и ответ может быть ложноположительным.

Анализ ПЦР на выявление туберкулезного инфицирования ― это частичное решение проблемы, в дополнение к массовой вакцинации, в борьбе со смертельными исходами в случае заболевания туберкулезом.

Теперь не нужно ждать обнаружения красноречивых симптомов или появления характерных для туберкулеза очагов на снимке после флюорографии.

При любом подозрении на возможное инфицирование дабы полностью исключить страшные последствия всегда есть возможность провести анализ на ПЦР.

Микобактерия туберкулеза (ПЦР)

Описание Подготовка Показания Интерпретация результатов

Туберкулез – это распространенное социально значимое заболевание, характеризующееся поражением лёгких (чаще) и других органов.

Возбудителями туберкулеза являются кислотоустойчивые бактерии рода Mycobacterium: Mycobacterium tuberculosis (занимает первое место по частоте заболеваний), Mycobacterium bovis (второе место), реже другие представители: M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. africanum.

Основной путь заражения туберкулезом – воздушно-капельный. Риск заразиться зависит от состояния иммунитета, частоты контакта с больным, бытовых и социальных условий.

Туберкулез в течение длительного времени может протекать скрыто, без каких – либо симптомов, его обнаружение в этом случае является случайной находкой при проведении флюорографии или рентгенографии грудной клетки.

При развитии симптоматики больного беспокоит слабость, субфебрильная температура, потливость (особенно в ночное время), далее – постоянный кашель с отхождением мокроты или кровохарканьем, насморк, затруднение дыхания.

Диагностика туберкулеза складывается из обследования лёгких (рентгенография, флюорграфия, если речь идет о легочной форме заболевания) и лабораторных методов (анализ на микобактерию туберкулеза).

Лабораторная диагностика туберкулеза включает в себя несколько методов: микроскопия мазка (чаще всего исследуют мокроту), классический культуральный метод, ИФА, ПЦР исследование крови на микобактерии туберкулеза. Всем им присущи достоинства, но и определённые недостатки, в частности, обнаружение микобактерий только в случае их достаточного количества.

Сегодня с большим успехом используется метод определения микобактерий туберкулеза в крови с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Микобактерия туберкулеза, а точнее её генетический материал (ДНК) обнаруживается в крови больного с помощью данного метода.

Высокая чувствительность ПЦР анализа на микобактерии туберкулеза позволяет обнаружить в крови больного единичные клетки микобактерий, дифференцировать ограниченные и диссеминированные формы туберкулёза, особенно у детей даже при отрицательных результатах микробиологических исследований.

ПЦР – это анализ на микобактерии туберкулеза, позволяющий обнаружить в крови больного генетический материал возбудителя заболевания, а значит подтвердить диагноз туберкулеза. Специфичность ПЦР анализа на микобактерии туберкулеза составляет 100%. Материалом для исследования является сыворотка крови.

Анализ на микобактерии туберкулеза ПЦР – методом представляет собой качественный тест. Это значит, что результата выдается в категориях «обнаружено»/ «не обнаружено». При методике ПЦР микобактерии туберкулеза обнаруживаются даже в том случае, если в крови они присутствуют в небольшом количестве, что объясняется высокой чувствительностью метода.

Чтобы сдать анализ на микобактерии туберкулеза, от пациента не требуется специальной подготовки.

Сдать анализ на микобактерии туберкулеза необходимо в следующих случаях:

Лихорадка, характеризующаяся ежедневным двойным повышением и понижением температуры тела. На фоне туберкулиновой гиперчувствительности или туберкулиновой анергии.
Острые воспалительные заболевания верхних и нижних дыхательных путей с длительным контактом с туберкулёзным больным в анамнезе.
Ненормальная реакция на туберкулиновую пробу (гиперчувствительность или анергия) на фоне обострения какого-либо системного заболевания.
Подозрение на системную волчанку.

Пцр диагностика туберкулеза у детей и взрослых

Современные методы диагностики (пцр, диаскинтест, квантифероновый тест) обладают высокой эффективностью, но на практике исследования не проверены. Туберкулинодиагностика была основой для выявления инфицированных и больных людей.

Способ позволил выявить много больных людей, снизить статистику заболеваемости, смертности.

Посев на микобактерии и микроскопия мокроты по Цилю-Нельсону позволяет достоверно диагностировать инфекцию. Проблема вызывает точное взятие мокроты прямо из пораженного бронха. На фоне туберкулезного процесса поражается значительная часть бронхиального дерева. После бактериального посева возможно проведение пробы на чувствительность возбудителя к антибиотику.

После анализа результатом диагностики фтизиатрам стало ясно, что отсутствие выделения палочки Коха не означает отсутствие инфицирования организма. Возбудитель может определяться после второго, третьего, четвертого взятия материала.

Современные диагностические методы (дст, Квантифероновый тест) выявляют микобактерии при активном течении заболевания. При наличии микобактерий внутри лимфатических узлов, при внелегочных формах заболевания тесты чаще всего отрицательны.

Своевременная диагностика составляет основу предотвращение серьезных осложнений и опасных последствий заболевания.

Современные методы

Заменой классической туберкулинодиагностике является диаскинтест (дст). Согласно последним постановлениям исследование должно заменить стандартную пробу Манту, которая позволила выявить много случаев заболеваемости, инфицированности среди населения.

Суть диаскинтеста, как и туберкулинодиагностики, предполагает подкожное введение белков возбудителей туберкулеза. В ответ на инъекцию вырабатывается реакция гиперчувствительности со специфическими кожными изменениями: покраснение, уплотнение, образование пузырей.

Положительный результат диаскинтеста характерен для пациентов с активным течением заболевания. При инфицировании или повышенной аллергизации исследование будет отрицательным. Отрицательный эффект дст может быть результатом сильного иммунитета, но при инфицировании человека.

При сравнении с Манту диаскинтест является более универсальным и чувствительным способом диагностики туберкулеза. Отсутствие выявления инфицированности требует его применения одновременно с туберкулинодиагностикой.

Несмотря на результаты клинических испытаний дст, ученые утверждают об общей универсальности и чувствительности способа, нельзя считать исследование универсальным диагностическим решением.

Разработан тест академиками НИИ Сеченова. Отсутствие аллергии при использовании диаскинтеста объясняется подкожным введением видоспецифичных туберкулезных белков. После их введения определяется кожная реакция в виде покраснения, уплотнений.

Что такое квантифероновый тест

Квантифероновый тест оценивается после взятия крови больного. Механизм действия процедуры заключается в определении гамма-интерферона, который высвобождается Т-лимфоцитами после встречи с микобактериями туберкулеза.

Тесты определяют туберкулезные белки, которые содержат не только бактерии человечьего и бычьего типов. Квантифероновый тест можно использовать также для диагностики микобактериозов, провоцируемых другими микобактериями, которые формируют специфические изменения на рентгенограмме.

Результат теста определяется в нескольких пробирках, что повышает диагностическую чувствительность метода.

Пцр для диагностики детского туберкулеза

Полимеразная цепная реакция – точный, но дорогостоящий метод диагностики туберкулеза. ПЦР проводится после бронхоскопии.

Рационально проведение полимеразной цепной реакции после получения отрицательных результатов. Результаты оцениваются после трехкратного посева мокроты на микобактерии туберкулеза. При самых благоприятных условиях выявление возбудителя свидетельствует об инфицированности. Назначение химиопрофилактики позволяет избежать активного туберкулезного процесса при наличии палочки Коха.

При получении штамма микроорганизма возможен посев на антибиотикочувствительность. Определение антибиотиков, способных уничтожать микроорганизмы, позволяет оценить, какими препаратами проводить лечение инфекции.

ПЦР у детей проводится при отрицательных результатах посева, но при наличии виража туберкулиновой пробы, визуализации рентгенологических признаков инфицирования, выявлении клинических симптомов текущей инфекции.

Полимеразная цепная реакция обеспечивает высокую точность (около 99%). Метод основан на амплификации нуклеиновых кислот. У микобактерий, вирусов и других микроорганизмов существуют уникальные последовательности нуклеотидов. Их диагностика позволяет выявить возбудителя заболевания.

Чувствительность пцр у детей менее низка, чем у взрослых. На практике выявлены следующие особенности полимеразной цепной реакции у ребенка:

Специфичность – 80-100%;
Чувствительность – 25-80%.

Несмотря на высокую достоверность метода, получение отрицательного результата не означает отсутствие туберкулеза у детей. Более рационально использование способа у пациентов с иммунодефицитными состояниями. При диагностике внелегочных форм туберкулезной инфекции.

Ошибки при интерпретации определяется нарушениями при заборе и подготовке материала для исследования.

Причины отрицательного результата пцр при диагностике туберкулеза

Распространение микобактерий по организму лимфогенным (по лимфатическим сосудам) и гематогенным (по кровеносному руслу) путем обеспечивает заселение многих тканей, появление внелегочных очагов инфекции.

При рентгенологическом определении очагов распада (деструкции) в легких нет необходимости проведения пцр. У взрослых с использованием рентгенографии можно выявить запущенные формы с высокой степенью достоверности.

У детей пцр исследование применяется чаще вследствие скрытой локализации микобактерий внутри лимфоузлов, что приводит к получению отрицательных результатов при применении других способов диагностики. При бактериальном посеве достаточно выявления около 10 микроорганизмов. Нужно учитывать, что не все отвечают за активный туберкулез легких.

Для правильной диагностики пцр, бактериального посева, дст следует соблюдать требования:

Хранить материал в стерильных пробирках;
Исключать попадание других бактерий;
При транспортировке соблюдать личную гигиену для предотвращения попадания биоматериала на тело, лицо, в дыхательные пути.

Храниться кровь вместе с консервантом ЭДТА. Существуют уникальные особенности приготовления материала для каждого лабораторного анализа, с которыми знакомы специалисты.

Инновационные методы диагностики

Раннее определение инфекции позволяет провести своевременную химиопрофилактику, предотвратить тяжелое течение заболевания.

Стертость клиники в детском возрасте, недостаточные результаты анализов, неграмотная интерпретация при оценке проб не позволяет своевременно верифицировать инфекцию. Для предотвращения детской заболеваемости требуется тщательный анализ результатов с возможностью установки диагноза на раннем этапе.

Современный способ лабораторной диагностики туберкулеза у детей – выявление TAB-TM

Реакция на определение Т-клеточного маркера у детей под названием «TAB-TM» характеризуется высокой чувствительностью. Суть метода заключается в выявлении особого кластера дифференцировки (CD-27), локализованного на поверхности Т-лимфоцитов. После выделения этого фактора проводится окрашивание цитокинов с цитометрией.

Метод в литературе стал описываться с 2014 года. Результаты наблюдений свидетельствуют о высокой чувствительности метода. Определение TAB-TM является экспресс методом диагностики туберкулеза путем исследования мокроты.

Анализ крови на туберкулез – что показывает

На начальном этапе туберкулезная инфекция протекает без специфической клинической симптоматики. Лабораторная диагностика у детей становится возможной тогда, когда палочка Коха размножается.

Какие клетки оцениваются при туберкулезном процессе в лабораторном анализе крови:

Эритроциты – красные клетки крови, отвечающие за перенос кислорода к тканям. При легком течении легочного туберкулеза со стороны красного ростка крови патологических изменений не прослеживается. Наличие деструктивного очага способствует кровотечению с анемией крови. Состояние развивается при туберкулезном воспалении стенки кишечника. Количество ретикулоцитов на фоне патологии увеличивается больше 1%;
Лейкоциты увеличиваются при любой инфекции. Лейкоцитоз сопровождается сдвигом лейкограммы влево. Повышение числа сегментоядерных нейтрофилов прослеживается на начальной стадии. При тяжелом туберкулезе с гнойным расплавлением, иммунодефицитных состояниях наблюдается лейкопения (снижение числа лейкоцитов крови). Одновременно повышается содержание лимфоцитов (свыше 20%);
Эозинофилия может прослеживаться на начальной стадии. Состояние возникает при туберкулезных инфильтратах разных органов. Тяжелое течение туберкулеза с распадом у взрослых приводит к полному отсутствию эозинофилов;
Повышение базофилов.

Лабораторный анализ на туберкулез не является специфичным ни для детей, ни для взрослых. Подобные изменения характерны для многих бактериальных или вирусных инфекций.

Показатели гемограммы предоставляют интерес для фтизиатров для определения стадии туберкулезного инфицирования.

При активной инфильтрации прослеживается лейкоцитоз вследствие увеличения количества нейтрофилов. В клетках появляется патологическая зернистость, что свидетельствует об интоксикации крови.

Очаги распада приводят к уменьшению числа эозинофилов, нейтрофилов, молодых форм, лимфоцитов. При диссеминации возникает абсолютный моноцитоз. На фоне рассасывания увеличивается число лимфоцитов и эозинофилов.

При уплотнении очагов гемограмма не характеризуется изменениями.

Анализы у детей на туберкулез: туберкулинодиагностика

Длительное время фтизиатры ставили реакцию Манту. Такие анализы на туберкулез позволяли выявлять не только активную инфекцию, но и инфицирование.

Суть пробы заключалась в подкожном введении туберкулина – вещества, которое обуславливало аллергизацию организма. Для теста применялся материал, получаемый из Micobacterium Bovis.

После подкожной инъекции получается папула, которая отражает реакцию организма на проникновения микобактерии:

Нормальная папула – размер от 5 до 16 мм;
При отсутствии реакции – ослабление иммунитета, отсутствие микобактерии;
Большая папула – наличие антигенов бактерии, контактирование с носителем туберкулезной палочки.

Метод не считается надежным из-за большого количества ложноположительных реакций. При сомнительных результатах требовалось подтверждение пцр. С появлением диаскинтеста (дст) ситуация изменилась. Сочетанное использование способов позволяет получить более достоверные результаты.

Классические «фтизиатрические» способы диагностики туберкулеза

Фтизиатры для диагностики туберкулеза у детей и взрослых используют следующие анализы:

Изучение анамнеза пациента (контакт с больным или носителем туберкулезной палочки). Определение социальных факторов риска помогает предположить возможное инфицирование;
Оценка туберкулиновой чувствительности (проба Манту) с PPD туберкулином в дозе 5-10 ТE. Оценка результата проводится через 48-72 часа;
Рентгенологическое исследование проводится у детей и взрослых при подозрении на туберкулез, вираже туберкулиновых проб;
Бактериологический посев является неопровержимым доказательством инфекции, спровоцированной микобактерий туберкулеза. При правильном сборе мокроты, обнаружении возбудителя в промывных водах желудка анализы на туберкулез можно считать положительными. Палочка Коха обнаруживается в гнойных абсцессах, лимфатических узлах, асцитическом выпоте, плевральном экссудате, моче, цереброспинальной жидкости;
Скорость оседания эритроцитов увеличивается при любой инфекции, в том числе туберкулезе;
ПЦР позволяет выявить специфического возбудителя, но исследование дорогостоящее;
Диаскинтест определяет легочный туберкулез, но часто дает отрицательные результаты при внелегочной локализации инфекции.

Современная диагностика туберкулеза при применении комплекса методов позволяет с высокой степенью достоверности определить микобактерию в организме. С помощью существующих способов выявляется активный процесс или инфицирование. Нужно лишь вовремя обратиться к специалистам!

Пцр на туберкулез: диагностика, сколько стоит анализ крови, мочи, мокроты, тест на микобактерии у детей, вместо манту ребенку

Одним их эффективных диагностических методов является метод ПЦР на туберкулез (полимеразная цепная реакция). Анализ представляет собой метод обнаружения возбудителя при помощи ДНК и РНК в организме человека.

Анализ высокочастотный, поэтому позволяет выявить микроорганизмы, которые являются возбудителями болезни, даже если они находятся в малом количестве. Для этого достаточно наличия единичного клеточного элемента.

Анализ проводится при помощи полимеразы, специфического фермента.

В каких случаях необходим пцр

Туберкулез – распространенное заболевание инфекционного происхождения, возбудитель которого – палочка Коха. К основным симптомам патологии относится кашель с выделением мокроты в течение длительного периода, кровохарканье, которое присоединяется на более поздних стадиях болезни, повышенная температура тела, постоянная слабость, потливость в ночное время, резкое похудение.

Туберкулез может поражать не только легкие, но и головной мозг, систему пищеварения, суставы, позвоночник, кожные покровы, мочеполовую систему. Болеют как взрослые, так и дети. Каждый год заболевают около 10 млн человек, из которых около 2 млн погибают. Патология передается воздушно-капельным путем, через органы пищеварения, быстро образует устойчивость ко многим медикаментозным средствам.

Важным моментом в лечении инфекции является вовремя обнаруженная болезнь.

Метод ПЦР для выявления туберкулеза полностью безопасный и применяется без ограничений. Проводится по направлению от фтизиатра, педиатра, терапевта или пульмонолога. В некоторых ситуациях ПЦР является единственным диагностическим методом, часто назначается:

при беременности, т.к. во время вынашивания ребенка рентгенологическое и флюорографическое исследования противопоказаны;
при контакте с источником инфекции;
при аллергической реакции;
при ВИЧ-инфекции;
при затрудненной постановке диагноза в случае болезней легких;
при обследовании перед проведением оперативных вмешательств;
в детском возрасте.

Другие методы также продолжают применяться в случаях, когда нет возможности провести ПЦР, – это туберкулинодиагностика или Манту, флюорографическое исследование, рентгенография легких. Данные обследования бесплатные, в отличие от ПЦР, но имеют свои недостатки.

ПЦР диагностика туберкулеза у детей – менее вредная процедура, чем рентген, при котором ребенок получит лишнюю и не нужную дозу облучения. Тест на туберкулез может вызвать проявление аллергической реакции у ребенка. Бактериологический анализ долго исследуется, результата можно ждать только через месяц. Поэтому при возможности проведения ПЦР ребенку лучше использовать его.

Противопоказания к методу

Противопоказаний для данного вида диагностики практически нет, можно использовать при простудных и других заболеваниях. Не рекомендуется проводить исследование сразу после прививки и курса противотуберкулезной терапии, т.к. остаточные микроорганизмы могут находиться некоторое время в крови и влияют на диагностику туберкулеза.

Преимущества и недостатки анализа

Диагностика туберкулеза данным методом – распространенная процедура, она имеет ряд преимуществ:

Высокая точность исследования, позволяющая высеять микобактерии в малых количествах.
Выявляет заболевание на самых ранних стадиях, еще до возникновения симптоматики.
С помощью этого метода получается с первого раза выявить возбудителя.
Все исследование (с получением результата) занимает не более 5 часов. При этом посев необходимо ждать несколько недель. Это особенно важно перед проведением оперативных вмешательств, в случае необходимости быстрой диагностики на наличие заболевания.
Метод эффективен при диагностике рецидива заболевания.
Для исследования применяется жидкий биологический материал.
Для проведения диагностики туберкулеза в легких более достоверную диагностическую информацию дает мокрота, при менингите туберкулезного происхождения исследуются участки спинного мозга.
Кровь помогает обнаружить местный очаг инфицирования, проверить степень чувствительности возбудителя к антибактериальной терапии, а при помощи этого назначается эффективное и правильное лечение.
Может использоваться вместо флюорографического и рентгенологического исследований, которые запрещены для проведения детям младшего возраста. При необходимости можно назначать исследование ПЦР на туберкулез вместо Манту.

Недостатки:

Главный – это достаточно высокая цена, поскольку для проведения исследования применяется дорогое современное оборудование. За счет этого в основном используется как метод дополнительной диагностики наряду с другими исследованиями.
Невозможность провести ПЦР сразу после курса лечения из за остаточных бактерий.
В некоторых случаях в результате мутирования бактерий – возбудителей заболевания – результат анализа может быть ложноположительным.

Виды анализа

Выбор того или иного биологического материала на исследование туберкулеза назначается индивидуально, это может быть кровь, мазок слюны, мокрота, моча.

Кровь

Анализ крови на туберкулез назначают в случае невозможности проведения других исследований.

Кроме того, он более безвреден для тех людей, которым рентгенографическое обследование способно принести вред.

Для того чтобы увидеть полную картину, иногда требуется сделать несколько снимков, а это лишнее облучение организма. Кровь может исследоваться и при получении сомнительных результатов флюорографии.

Слюна

Анализ ПЦР на туберкулез слюны не такой информативный, как исследование крови, потому что туберкулезная инфекция не действует на слюнные железы. В результате ответ почти всегда отрицательный.

Туберкулез — не приговор! Наша постоянная читательница порекомендовала действенный метод! Новое открытие! Ученые выявили лучшее средство, которое моментально избавит вас от туберкулеза. 5 лет исследований!!! Самостоятельное лечение в домашних условиях! Тщательно ознакомившись с ним, мы решили предложить его и вашему вниманию.

Тем не менее ПЦР-тест слюны может выявить легочные и внелегочные формы протекания заболевания. В случае если при воздействии реагента цветовая гамма исследуемого образца не поменялась, микобактерии туберкулеза не обнаружены. При сомнительном результате проводится ряд дополнительных обследований.

Мокрота

Анализ мокроты на туберкулез берется на исследование 3 раза во избежание неточного результата. При начальной стадии инфицирования мокрота будет выделяться в малом количестве, при запущенной патологии будут присутствовать кровянистые включения.

При подозрении на туберкулез костей или нервной системы данное исследование информативным не будет.

Моча

Анализ мочи помогает выявить туберкулез внелегочной формы – мочеполовых органов. При поражении легких данное исследование не информативно.

Сдача ПЦР мочи на туберкулез требует подготовки. Накануне процедуры нужно исключить прием лекарственных препаратов, сексуальные контакты. Брать материал следует в утренние часы, стараться за несколько дней до проведения процедуры не употреблять в пищу продукты, которые могут окрасить мочу в различные цвета.

Подготовка к процедуре

Во избежание получения ложного или не информативного результата рекомендовано придерживаться следующих правил:

Перед ПЦР-анализом на туберкулез в течение 8 часов воздержаться от приема пищи.
Не употреблять алкоголь и не курить в течение 6 часов перед процедурой.
Перед исследованием не принимать лекарственные препараты.
Мокроту собирать утром после чистки зубов и полоскания ротовой полости кипяченой водой.
При небольшом количестве выделяемого экссудата накануне выпить препарат с отхаркивающим действием или провести ингаляцию. Наиболее информативная мокрота та, в которой присутствуют слизь, гной с белыми или желтоватыми вкраплениями.

При невозможности взятия мокроты на исследование применяют смыв из области бронхов, он не требует специальной подготовки. Проводится путем вливания пациенту в трахею раствора натрия хлорида, который провоцирует кашель с жидкостью. Она и используется для дальнейшего исследования.

Повлиять на точность результата могут некоторые лекарственные препараты, особенно антибиотики и гепарин. По этой причине за 3 дня до проведения процедуры следует исключить их применение.

Как производится забор крови

Процедура проходит с использованием амплификатора, исследование состоит из 4 этапов. Для анализа берутся участки ДНК, в которых начинается процесс синтезирования молекул, нуклеотидов, полимеразанов. Образцы прогреваются до температуры 98°С для того, чтобы разрушилась первичная структура ДНК-цепочки.

Затем праймер связывается с нитью ДНК при помощи отжига и снижения температуры на несколько градусов.

После 25-30 идентичных циклов образуется некоторое число копий ДНК вирусов, по которым уже и определяется возбудитель болезни. Этот анализ может заменять Манту ребенку. Результат исследования может быть положительным в течение некоторого времени, т. к. анализ ПЦР не идентифицирует мертвые микобактерии от живых.

Расшифровка результатов

Срок проведения исследования на ПЦР при туберкулезе составляет 6-7 часов. Может быть 2 варианта ответа:

Обнаружено – в исследуемом материале нашли ДНК микобактерии туберкулеза. Возможность заражения – примерно 98%. При таком результате доктором проводится развернутая расшифровка анализа, которая определяет стадию протекания заболевания и ее очаговое расположение. Таких пациентов немедленно отправляют в противотуберкулезный диспансер для проведения лечения.
Не обнаружено – возбудитель заболевания отсутствует.

Сколько стоит анализ

Анализ крови ПЦР на туберкулез стоит от 240 до 365 руб., цена зависит от города. Самый дорогостоящий анализ в Москве, в остальных регионах цена на исследование примерно одинаковая.

Mycobacterium tuberculosis, ДНК

Общая информация об исследовании

Туберкулез (от лат. tuberculum – «бугорок») – инфекционное заболевание человека и животных, передающееся преимущественно воздушно-капельным путем.

Риск заразиться повышает подавление иммунитета, вызванное ВИЧ/СПИДом, диабетом, заболеванием почек, трансплантацией органов и применением иммуносупрессоров, беременностью, старением. Кроме того, наиболее подвержены ему те, кто контактирует с больными туберкулезом, а также дети до 5 лет после виража туберкулиновой пробы.

К наиболее уязвимым группам населения относят бездомных, заключенных, мигрантов из стран с высокой заболеваемостью туберкулезом, наркопотребителей, а также пожилых людей.

Для данного исследования используется тест-система, основанная на выявлении геномной ДНК возбудителя туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР). В современной диагностике это один из самых быстрых, универсальных и высокочувствительных методов.

Стандартные способы обнаружения микобактерий туберкулеза базируются на выращивании патогенных микроорганизмов в питательной среде. Сложности связаны с низкой скоростью роста колоний Mycobacterium tuberculosis – необходимо ожидать до 1,5 месяцев после взятия материала.

Высокой чувствительностью и специфичностью обладают молекулярно-биологические методы, основанные на детекции генетического материала микобактерий туберкулеза. Их важнейшим преимуществом является высокая скорость получения результата. Использование ПЦР реал-тайм позволяет выявить возбудитель туберкулеза уже в день получения клинического образца.

Бактериемия (попадание в кровь пациента микобактерий) может возникать на ранних стадиях туберкулезной инфекции, а также при развитии генерализованного или внелегочного туберкулеза.

Она опасна тем, что иммунный ответ на бактерии вызовет сепсис и септический шок, чреватый смертью.

Риск развития генерализованного туберкулеза наиболее высок у пациентов с ВИЧ на поздних стадиях, у тех, кто прервал противотуберкулезную терапию, а также у не обратившихся вовремя за медицинской помощью при появлении симптомов туберкулеза.

Диагностика туберкулеза у ВИЧ-инфицированных затруднена из-за иммуносупрессированного состояния организма, что зачастую проявляется в ложноотрицательных результатах туберкулиновых реакций и микробиологических тестов. В связи с этим тестирование на Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР реал-тайм имеет большое значение.

Для чего используется исследование?

Для диагностики туберкулеза легких (в частности, его генерализованных и внелегочных, связанных с бактериемией, форм), и контроля за его лечением.

Когда назначается исследование?

При подозрении на внелегочный туберкулез.
При симптомах бактериемии на фоне туберкулезной инфекции: повышенной температуре тела, потливости и пр. (при небольшом количестве бактерий в крови бактериемия может протекать бессимптомно).
Если у пациента был длительный контакт с больным туберкулезом.
При ненормальной реакции на туберкулиновую пробу у детей.
Когда у пациента ВИЧ-инфекция.